Die eigene DNA zu Hause sequenzieren

 (bradleywoolf.com)
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  • Für Menschen, die mit eigener Ausrüstung eine Genomsequenzierung ausprobieren wollen, wird ein praktischer Home-Lab-Ablauf von der Entnahme von Wangenzellen bis zur VCF-Analyse als durchgehender Prozess samt benötigter Ausrüstung zusammengefasst
  • Zellen von der Wangenschleimhaut, die als Versuchssample dienen, sind leicht zu beschaffen, eignen sich aber nicht für Fragen, die einen Gewebekontext erfordern, etwa Krebsdiagnostik oder Analysen von Entzündungen bzw. Genexpression in bestimmten Geweben
  • Der Wert von Genomdaten liegt weniger in einer sofortigen Diagnose als darin, ein VCF als abfragbare Referenzschicht aufzubauen, um Varianten mit VEP, ClinVar, gnomAD, PharmGKB, Gene Inspector, Claude und anderen zu untersuchen
  • Die Vorbereitung dauerte rund zwei Monate, und allein das MinION kostet etwa 7.500 US-Dollar. Berücksichtigt man Geräte, Reagenzien, Verbrauchsmaterialien und die Analyseumgebung, ist die Kostenhürde für Privatpersonen derzeit noch hoch
  • Durchläufe mit geringem Input und niedriger Coverage sollten nicht als medizinisch belastbare Interpretation, sondern als technische Validierung betrachtet werden; wichtig ist, Varianten bei niedriger Coverage nicht zu überinterpretieren

Umfang und Grenzen der DNA-Sequenzierung zu Hause

  • Basiert auf der Erfahrung, das eigene Genom fünfmal mit dem Oxford Nanopore Technologies MinION sequenziert zu haben
    • Zellen von der Wangenschleimhaut werden mit einem Tupfer entnommen
    • Als Sample für die Sequenzierung vorbereitet
    • Auf den Sequencer geladen
    • Die resultierenden Daten analysiert
  • Wangenzellen lassen sich leicht gewinnen und werden schnell nachgebildet, sind aber nicht für alle biologischen Fragestellungen geeignet
    • Für Krebsdiagnostik werden sie nicht verwendet
    • Sie eignen sich nicht zur Entzündungsdiagnostik oder zur Prüfung, welche Gene in anderen Körperregionen aktiviert werden
    • Wenn man Gene sehen will, die in Entzündungszellen eines Hautausschlags im Brustbereich exprimiert werden, muss man die betroffenen Zellen mit normalen Zellen vergleichen
  • Die gesamte Vorbereitung dauerte etwa zwei Monate, und die Kosten liegen noch auf einem Niveau, das für die durchschnittliche Privatperson schwer zugänglich ist
    • Die Kosten sinken jedoch
    • Langfristig wird es für möglich gehalten, dass Technologien ähnlich wie Smartphones oder KI DNA- und RNA-Expression in Echtzeit anzeigen können

Was sich mit Genomdaten machen lässt

  • Ein Genom ist keine „Magie“, sondern eine Referenzschicht; mit einem VCF kann man viele Werkzeuge darauf ansetzen
  • Verwendbare Werkzeuge sind VEP, ClinVar, gnomAD, PharmGKB, Gene Inspector, Claude und andere
  • Auf Basis eines VCF lassen sich unter anderem folgende Fragen untersuchen
    • Welche Varianten liegen vor
    • Welche Gene und Signalwege betroffen sind
    • Welche Medikamente womöglich anders verstoffwechselt werden
    • Welche seltenen Varianten genauer betrachtet werden sollten
    • Wo die Modelle noch Lücken haben
  • Die erzeugten Informationen haben derzeit noch kein Diagnose-Niveau
    • Es ist auch keine Schlussfolgerung im Sinne von „Die KI hat es gesagt, also sollte man sich mit CRISPR selbst editieren“
    • Der kurzfristige Wert liegt darin, ein statisches Genom in eine abfragbare Form zu überführen
  • DNA ist eine stabile Referenz, RNA liegt näher am aktuellen Zustand, und langfristig könnten Biosensordaten in ein einziges persönliches Modell integriert werden

Benötigte Geräte und Verbrauchsmaterialien

  • Die zentrale Hardware ist das Oxford Nanopore Technologies MinION, Preis: 7.500 US-Dollar
    • Ein Laptop oder eine Workstation zum Ausführen von MinKNOW
    • Mindestens 100 GB Speicher für die Ausgabe
    • Eine GPU für das Basecalling mit Dorado
    • Vortex, Heat Block, Zentrifuge
  • Zu den wichtigsten Verbrauchsmaterialien gehören ONT-Sequenzierungskits, Flow-Cell-Reinigungskits, Kontrollmaterial, PBS und Tupfer für Wangenzellen
  • Die Reagenzien gliedern sich in DNA-Extraktion, Library Preparation, Flow-Cell-Priming und Quantifizierung
  • Zusätzliche Bench-Geräte und Kunststoffverbrauchsmaterialien werden ebenfalls benötigt
    • Microcentrifuge, Magnetic Rack, Tube Racks, Ice Bucket, -20°C-Freezer, 4°C-Kühlschrank, Pipetten
    • Sterile Wangentupfer, LoBind-Tubes, PCR-Tubes, Qubit-Assay-Tubes, Filterspitzen, Wide-Bore-P200-Spitzen, Handschuhe

Versuchsablauf: von der Entnahme bis zur finalen Library

  • Das Gesamtziel ist, zwei Wangentupfer-Proben in eine mit dem MinION sequenzierbare Library zu verwandeln
  • Zur Vorbereitung gehören das Anziehen von Handschuhen, das Reinigen der Arbeitsfläche, das Beschriften der Röhrchen, das Temperieren von AMPure XP Beads auf Raumtemperatur, das Kühlen der Enzyme, das Einstellen des Heat Blocks auf 56°C und die Kontrolle der ONT-Reagenzien
  • Die Zellentnahme und -konzentration läuft so ab, dass die Innenseite der Wange 60 Sekunden lang abgestrichen, der Tupfer in PBS gegeben und per Zentrifugation ein kleines weißes oder grauweißes Pellet gewonnen wird
    • PBS kann leicht trüb werden
    • Wichtig ist, das Pellet nicht mit anzusaugen
  • Mit dem Monarch-Kit werden die Zellen lysiert und die DNA an Capture Beads gebunden
    • Nach der Lyse hat der Erhalt hochmolekularer DNA Priorität, daher wird kein Vortex verwendet
    • Die DNA-gebundenen Beads dürfen nicht verloren gehen
    • Dem gDNA Wash Buffer muss Ethanol bereits zugesetzt worden sein
  • Die gereinigte genomische DNA wird mit Qubit quantifiziert
    • Verwendet wird 1x dsDNA High Sensitivity
    • Ist die Probenkonzentration zu niedrig, wird in einem neuen Qubit-Tube mit mehr DNA erneut gemessen
    • Gibt man nur DNA in das bestehende Tube nach, stimmt die Assay-Berechnung nicht mehr
  • Eine Unterbrechung eignet sich am besten direkt nach der DNA-Extraktion
    • Die DNA wird in einem LoBind-Tube klar beschriftet
    • Nach einem Quick Spin wird sie ohne Vortex bei 4°C gekühlt gelagert

Library Preparation und Laden der Flow Cell

  • Der ideale Input für Repair/End-Prep beträgt 1.000 ng DNA in 47 µL
    • Wenn die DNA zu stark verdünnt ist und 1.000 ng nicht in 47 µL passen, wird das maximal mögliche Volumen verwendet
    • Ein Beispiel für einen ersten Low-Input-Durchlauf war 0,296 ng/µL × 47 µL, also etwa 13,9 ng. Das lag weit unter dem empfohlenen Input, war aber für eine End-to-End-Übung dennoch nützlich
  • Für Repair/End-Prep werden FFPE DNA Repair Buffer v2, FFPE DNA Repair Mix und N-Prep Enzyme Mix verwendet
    • Salt-T4 DNA Ligase wird nicht in diesem Schritt, sondern später verwendet
    • Wenn kein DCS verwendet wird, wird das optionale 1 µL DCS durch nuclease-free water ersetzt
  • Nach dem AMPure Cleanup werden per Adapter-Ligation ONT-Sequenzierungsadapter angefügt
    • Die Reaktion enthält repaired/end-prepped DNA, LNB, Salt-T4 DNA Ligase und LA
    • Ohne LA entsteht keine sequenzierbare Library
    • Ohne Salt-T4 DNA Ligase schlägt die Adapter-Ligation fehl
    • Wenn LNB nicht korrekt gemischt wird, leidet die Ligation-Chemie
    • Vortex wird vermieden, da es zu DNA-Shearing führen kann
  • Für das Cleanup der adapter-ligierten Library wird nicht Ethanol, sondern LFB verwendet
    • Die praktische Regel lautet: „Liquid moves. Beads stay.“
    • In die finale Library werden keine Beads übernommen
  • Auch die finale Library wird erneut mit Qubit quantifiziert
    • Bei Low-Input-Durchläufen können die Werte niedrig sein oder die Messung kann fehlschlagen
    • Bei Übungsdurchläufen kann man statt die Library wiederholt mit Qubit zu verbrauchen direkt mit 12 µL Library in den Loading Mix gehen

MinION-Lauf und Datenverarbeitung

  • In MinKNOW wird die Flow Cell geprüft und die Zahl aktiver Poren notiert
    • Über 1200: gut
    • 800–1200: brauchbar
    • 500–800: grenzwertig oder für Übungszwecke
    • Unter 500: schlecht, aber für mechanische Übungen noch verwendbar
    • Unter 200: abgesehen von Ladeübungen praktisch kaum wertvoll
  • Im letzten Schritt werden drei Tubes behandelt
    • Final library: die DNA-Library nach dem Adapter-Cleanup
    • Priming mix: zur Vorbereitung der Flow Cell
    • Loading mix: enthält final library, sequencing buffer und library beads
  • Die Flow Cell hat zwei Ports
    • Priming port: unter der Schiebeabdeckung, hier kommt der Priming Mix hinein
    • SpotON sample port: ein kleines Sample-Well, in das der Loading Mix tropfenweise gegeben wird
  • Die Final library wird nicht direkt auf die Flow Cell gegeben, sondern zuerst in das Tube für den Loading Mix
  • Die Standardkonfiguration in MinKNOW ist wie folgt
    • Flow cell type: FLO-MIN114
    • Kit: SQK-LSK114
    • Basecalling: ON
    • Model: High-accuracy / HAC
    • Barcoding: OFF
    • Alignment: OFF
    • Adaptive sampling: OFF
    • Raw reads / POD5: ON
    • Filtering: bei Low-Input-Übungsdurchläufen OFF
  • Bei Low-Input-Übungsdurchläufen wird empfohlen, Raw POD5 zu aktivieren, damit die Daten später analysiert werden können, auch wenn die Live-Ausgabe nicht gut aussieht

Analyse-Pipeline

  • Falls nötig, wird nach dem Lauf mit Dorado basecalling durchgeführt
    • dorado basecaller sup pod5_directory/ > calls.bam
    • Falls nötig, Umwandlung in FASTQ mit samtools fastq calls.bam > reads.fastq
    • Für eine schnelle erste Prüfung kann statt SUP auch HAC verwendet werden
  • Als humane Referenz wird GRCh38 FASTA verwendet
    • Mit minimap2 wird ein Reference-Index erstellt
    • Die Reads werden mit map-ont ausgerichtet
    • Mit samtools werden BAM-Index und flagstat erzeugt, mit mosdepth wird die Coverage geprüft
  • Das Variant Calling erfolgt mit Clair3 und ONT-Modellen
    • Die Ausgabe muss ein VCF enthalten
    • Varianten bei niedriger Coverage werden nicht überinterpretiert
    • Der erste MinION-Lauf wird nicht als medizinisch belastbare Interpretation, sondern als technische Validierung behandelt
  • Für die Annotation wird VEP installiert und das VCF auf Basis von GRCh38 annotiert
    • ClinVar, gnomAD und PharmGKB werden ergänzt
    • Die finale Tabelle enthält chromosome, position, ref, alt, gene, consequence, ClinVar significance, gnomAD frequency, genotype, read depth und variant quality

Referenzen

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1 Kommentare

 
GN⁺ 4 시간 전
Meinungen auf Hacker News

  • Ich möchte nicht unbedingt selbst zu Hause sequenzieren, würde es aber gern mit einem Drittanbieter-Service ausprobieren, der mir die vollständigen Rohdaten liefert.
    Ich bin ein normaler Verbraucher in Europa und frage mich, welchen Dienst man dafür empfehlen kann. Es wäre ein großer Vorteil, wenn der Anbieter die Daten nicht speichert, aber ich weiß nicht, ob man so viel verlangen kann.

    • Datenbanken von Drittanbietern können am Ende ohnehin geleakt werden; dann sollte man auch nicht vergessen, seine DNA zu ändern.
      Siehe den 23andMe-Leak: https://en.wikipedia.org/wiki/23andMe_data_leak
    • YSEQ ist im Grunde eher ein kleiner Familienbetrieb. Zwei deutsche Wissenschaftler, die beim Aufbau des Labors von Family Tree DNA in Texas geholfen hatten, kehrten nach Deutschland zurück und gründeten dort einen kleinen Wettbewerber im Bereich hochauflösender Y-DNA-Sequenzierung für Genealogen.
      Auf Anfrage machen sie auch hochauflösende Whole-Genome-Sequencing-Analysen. Allerdings dauert es lange, und sie behalten sich offenbar vor, Bestellungen zu stornieren, wenn man sich über Verzögerungen beschwert. Es ist nicht die günstigste Option, aber aus europäischer Datenschutzsicht halte ich sie für ziemlich gut. Je wichtiger Privatsphäre ist, desto eher kann ein etwas „schwieriger“ Anbieter sogar besser sein.
    • Ich habe früher zufällig einen Krebsforscher getroffen, der wegen einer Konferenz in der Stadt war, und ihm dieselbe Frage gestellt. Er meinte, ich solle direkt die Kontaktperson auf der Website eines lokalen Forschungslabors anschreiben und fragen, ob sie helfen kann oder wohin ich mich wenden sollte.
      Er sagte, er habe das in mehreren Ländern selbst so gemacht, aber ich weiß immer noch nicht, ob die Leute ihm wegen seines Titels geholfen haben. Trotzdem war er überzeugt, dass man auch als einfacher Software Engineer jemanden finden könne, der hilft. Wenn es in der Nähe ein Forschungslabor gibt, ist es einen Versuch wert.
    • Ich habe myheritage genutzt, danach alle Daten exportiert und die Schließung des Kontos sowie die Löschung der Daten beantragt.
      Der Hauptgrund für meine Wahl war, dass es dort gerade ein günstiges Angebot für 30 Euro gab.
    • Ich brauche Long-Read-Rohdaten. Ich bin ein normaler Verbraucher in Europa, insbesondere in Deutschland, und frage mich, ob es Drittanbieter gibt, die so etwas anbieten, und was es kostet.
      Long Reads brauche ich, weil die gewünschten Informationen in nahezu identischen, duplizierten Genen liegen. Ich habe FASTQ- und BAM-Dateien von Dante Labs, konnte daraus aber die gesuchten Informationen nicht extrahieren.

  • Ich verstehe nicht, was dieser magisch klingende Teil bedeuten soll: „Das Dokument ist dafür gemacht, von KI gelesen zu werden; kopiere die URL in ChatGPT und lass dich anleiten. Noch besser ist es mit einer AR-Brille, dann kann die KI dich durch das gesamte Protokoll führen.“

    • Aus Sicht des Autors war Hands-free-Prozessführung gemeint. Wenn man es in ChatGPT oder Claude hochlädt und sich im Dialog durch die Schritte führen lässt, ist es einfacher, den Ablauf durchzuführen, als jedes Mal zum Computerbildschirm zurückzugehen und nachzusehen; außerdem reduziert es Kontextwechsel.
      Man kann es natürlich auch selbst lesen, aber der Inhalt ist ziemlich dicht.
    • Die Absicht scheint zu sein, konkrete, aber komprimierte Notizen bereitzustellen und die fehlenden Erklärungen von einem großen Sprachmodell zu einer Schritt-für-Schritt-Anleitung auffüllen zu lassen.
    • Das wirkt wie ein ziemlich kluger Ansatz. Viele Leute werden einen Blogpost nicht direkt lesen, sondern GPT den Text verstehen lassen und sich eine Zusammenfassung oder nur die benötigten Teile holen. Der Autor hat das Material also so erstellt, dass es für das Ergebnis dieses üblichen Nachverarbeitungsschritts optimiert ist.

  • Ich hatte einmal über eine Firma nachgedacht, die Wurzeln aus Abwasserrohren holt, sie bei Bedarf per Sequenzierung als bestimmte Pflanzen identifiziert und einem sagt, was man abtöten muss, bevor das Abwasserrohr einstürzt.
    Wenn man dadurch den Austausch eines Abwasserrohrs für 10.000 Dollar um ein paar Jahre aufschieben kann, würden vermutlich viele Leute 100 Dollar zahlen.

    • https://www.envirodna.com/

      https://www.naturemetrics.com/species-detection

      https://www.ednacollab.org/industry/

      https://wilderlab.co/

      Diese Firmen konzentrieren sich auf Umwelt-DNA. Einige sind eher im Monitoring für Kommunen unterwegs, andere richten sich auch an Privatkunden.

    • Ich bin mir nicht sicher, warum das nötig ist. Wie viel besser ist eine Methode, eine bestimmte Pflanze abzutöten, als eine Methode, die gegen alle infrage kommenden Pflanzen wirkt? Man könnte doch mehrere Arten von Herbizidbehandlungen kombinieren; ich vermute, solche Optionen wären günstiger als dieser Service.

    • Das ist wirklich eine clevere Idee, und unter den richtigen Bedingungen würde ich sicher dafür bezahlen.
      Andererseits frage ich mich, ob man nicht einfach ein biologisch abbaubares Breitbandherbizid in den Abfluss kippen könnte und damit günstiger denselben Effekt erzielt.

    • Ich frage mich, wie man vorgehen müsste, damit genügend Leute von dem Service erfahren und ihn bestellen. Hier denke ich an eine minimal tragfähige Geschäftschance.

    • Es ist schon schwierig, für unter 100 Dollar überhaupt einen Klempner an die Haustür zu bekommen. Ich frage mich, ob 500 Dollar gemeint waren oder ob sich die 100 Dollar nur auf den Laboranalyse-Teil beziehen.

  • Ich wünschte, es gäbe eine Diskussion der Ergebnisse. Frühere Berichte zu diesem Sensor und Prozess fielen ziemlich gemischt aus.
    Der Prozess selbst ist cool, aber ich würde gern wissen, wie brauchbar die Ergebnisse aus realen Umgebungen tatsächlich sind.

  • https://www.the-odin.com/whole-genome-sequencing-30x/

    Wenn es schnell und vergleichsweise günstig sein soll, gibt es eine Option für 599 Dollar.

    • Unterliegt ein Labor mit Sitz in den USA dann nicht CLIA und dessen Aufbewahrungspflichten?
      Für 7.500 Dollar oder mehr bekommt man garantierte Privatsphäre. Andere Eigenschaften können, wie in den Kommentaren beschrieben, anders sein, aber zumindest verlassen die Daten nicht das eigene Zuhause.
    • Service und Ausrüstung sind nicht dasselbe.

  • Ich möchte zwar sequenzieren, aber nicht, dass irgendein Unternehmen, eine Regierung oder religiöse Organisation Zugriff auf meine Daten bekommt.
    Wenn der Autor sagt: „Wenn man eine VCF hat, kann man sie durch Tools wie VEP, ClinVar, gnomAD, PharmGKB, Gene Inspector oder Claude laufen lassen“, landen meine Daten dann nicht genau in den Händen der Akteure, die ich vermeiden will?

    • Bei VEP, ClinVar, gnomAD ist das nicht der Fall. Das sind Open-Source-Tools oder Datenbanken, die man offline nutzen kann. Wenn man sie herunterlädt oder abfragt, kann das niemand wissen.
      Bei Claude hingegen gibt man die Daten tatsächlich weiter. Dieser Schritt ist aber nicht zwingend nötig. Wenn man eine Standard-Pipeline laufen lässt, erhält man eine VCF-Datei mit genomischen Varianten und kann jede Variante annotieren. Anhand der annotierten Gene kann man beurteilen, ob eine Variante pathogen, wahrscheinlich pathogen, eher nicht pathogen oder gutartig ist.

  • Dass man so etwas mit einem handflächengroßen Gerät machen kann, ist wirklich erstaunlich. Wenn jetzt noch ein CRISPR-Gerät ähnlicher Größe kommt, sind wir bei der Handlung von Gattaca angekommen, also sollten wir hier wohl aufhören.

  • Ich habe in einem Nasslabor Erfahrung mit DNA-Entnahme und Sequenzierung gesammelt, wenn auch vor fast 20 Jahren, und diese Arbeit ist schwierig und scheitert oft. Besonders ohne extrem saubere Umgebung scheitert sie noch viel häufiger.
    Auch nachdem Daten entstanden sind, muss man sich fragen, wie zuverlässig sie angesichts der Erhebungsumgebung sind, und auch korrelierte Sequenzierungsfehler betrachten, die nicht berücksichtigt wurden. Außerdem ist genetische Beratung tatsächlich ein Fachgebiet, das Menschen studieren. Bevor man ein großes Sprachmodell fragt, was genetische Daten für einen selbst bedeuten, sollte man Zugang zu jemandem haben, der die Daten in den richtigen Kontext setzen und einen mit einschlägigen Fachleuten verbinden kann. Selbst mit einem Doktortitel in diesem Bereich wäre ich nicht zuversichtlich, meine eigenen Daten nüchtern und rational zu interpretieren.
    Nebenbei: Ich weiß nicht, warum der Link zu Molecular Biology of the Cell auf die 6. Auflage verweist und nicht auf die vor vier Jahren erschienene 7. Auflage. An den ersten drei Auflagen war während meiner ersten Promotion mein Betreuer als Koautor beteiligt; er war derjenige, der gezeigt hat, dass Roger Penroses Idee, Mikrotubuli seien für die Chemotaxis von E. coli wichtig, völliger Unsinn war. Ein großartiger Mensch. 2007 habe ich Illumina-Daten analysiert, damals kommerziell noch sehr früh; weil man sie an ein Referenzgenom alignen konnte, ließen sich bestimmte Verzerrungen identifizieren. Bei der Nanopore-Technologie gibt es sehr wahrscheinlich noch mehr solcher Verzerrungen, und wenn man sie nicht berücksichtigen kann, kann man in große Schwierigkeiten geraten.

    • Nanopore-Daten sind viel einfacher zu analysieren als Short-Read-Sequenzierungsdaten. Weil die Reads sehr lang ausfallen, hat man nicht dieselben Alignment- und Assembly-Probleme.
      So sehe ich das auch aus Sicht eines Biochemie-Masters.
    • Die Sequenzierungstechnologie von Oxford Nanopore ist in der Nutzung ziemlich robust. Man muss zwar ein Kit kaufen, aber es ist durchaus machbar und überhaupt nicht damit zu vergleichen, selbst Gele zu gießen oder radioaktiv markierte Sanger-Reaktionen durchzuführen.
      Statt ein Unternehmen für persönliche Genomik zu nutzen, kann man auch eine Firma beauftragen, die Sequenzierungs-Outsourcing für Labore anbietet. Was die Risiken der Interpretation angeht, stimme ich vollkommen zu.

  • Mir gefällt, dass auf Privatsphäre geachtet wird. Abgesehen vom offensichtlichen Problem „durch Claude laufen lassen“ frage ich mich, wie viele der genannten Analyse-Tools vollständig Open Source sind oder zumindest lokal ausgeführt werden können.
    Es wäre gut gewesen, wenn der Beitrag darauf eingegangen wäre.

    • Beim groben Überfliegen sieht es so aus, als hätten alle ihren Quellcode veröffentlicht und würden auch lokal laufen.

  • Woher weiß ich, ob die Ergebnisse, die ich bekommen habe, echt sind oder einfach nur Müll?