- Das Y-Chromosom, das wegen langer palindromischer Strukturen und repetitiver Sequenzen bis zuletzt Lücken aufwies, wurde mit T2T-Y vervollständigt und schließt damit eine große Lücke im menschlichen Referenzgenom
- Im bisherigen GRCh38-Y fehlte mehr als die Hälfte des Y-Chromosoms; die neue Sequenz umfasst 62.460.029 Basenpaare (bp) und ergänzt mehr als 30 Millionen bp
- Die vervollständigte Sequenz zeigt die ampliconische Struktur der Genfamilien TSPY, DAZ, RBMY und legt 41 zusätzliche proteinkodierende Gene offen, von denen die meisten zur TSPY-Familie gehören
- In der heterochromatischen Region Yq12 erscheinen human satellite 1·3-Blöcke abwechselnd, wodurch sich repetitive Sequenzen, Satelliten-DNA und die Verteilung von non-B-DNA-Motiven über das gesamte Chromosom analysieren lassen
- T2T-Y wird mit dem CHM13-Genom-Assembly kombiniert und dient damit als vollständige Referenzsequenz-Ressource für alle 24 menschlichen Chromosomen
Die letzte verbliebene Lücke im Y-Chromosom
- Das menschliche Y-Chromosom war wegen komplexer repetitiver Strukturen mit langen palindromischen Mustern, Tandemwiederholungen und segmentalen Duplikationen sehr schwer zu sequenzieren und zu assemblieren
- In der Referenzsequenz GRCh38 fehlte mehr als die Hälfte des Y-Chromosoms, und das Y-Chromosom blieb das letzte unvollständig fertiggestellte menschliche Chromosom
- Das T2T consortium stellte mit T2T-Y die vollständige Sequenz des menschlichen Y-Chromosoms aus dem HG002-Genom mit 62.460.029 bp fertig
- T2T-Y korrigiert mehrere Fehler in GRCh38-Y und fügt der Referenzsequenz mehr als 30 Millionen bp hinzu
Neu sichtbar gewordene Gene und Wiederholungsstrukturen
- T2T-Y zeigt die vollständige ampliconische Struktur der Genfamilien TSPY, DAZ, RBMY
- Die neue Referenzsequenz enthält zusätzlich 41 proteinkodierende Gene, von denen die meisten zur TSPY-Familie gehören
- In der heterochromatischen Region Yq12 wurde ein abwechselndes Muster von human satellite 1- und 3-Blöcken bestätigt
- Mit der abgeschlossenen Assemblierung konnte die repetitive Struktur des Y-Chromosoms als Ganzes bewertet werden, und zuvor unbekannte satellite arrays wurden ebenfalls identifiziert
- Das neue satellite array befand sich überwiegend in PAR1
- Außerdem wurden subunit repeats identifiziert, die innerhalb einer composite repeat unit von TSPY, RBMY oder DAZ liegen
Strukturelle Herausforderungen im Assemblierungsprozess
- Die Assemblierung der X/Y-Chromosomen von HG002 wurde mit einem auf HiFi reads basierenden assembly string graph analysiert
- Die komplexesten tangled Strukturen waren auf die heterochromatic satellite region des Y-q-Arms beschränkt
- Der X/Y-subgraph war über PAR1 und PAR2 verbunden
- In PAR1 wurde eine durch HiFi sequencing bias verursachte graph discontinuity beobachtet
- 9 der 11 beobachteten Brüche lagen in PAR1 der beiden Chromosomen
- Beim Y-Chromosom lagen 5 von 5 in PAR1
- In der palindromischen Region P1–P3 wurde die Wiederholungsstruktur durch manuelles Pruning und die Integration von ONT reads aufgelöst
- Hervorgehoben wurden drei Hairpin-Strukturen in Form nahezu vollständiger inverted tandem repeats, die das gesamte P3 und zwei Palindrome von P2 umfassen
- Verbleibende Mehrdeutigkeiten wurden durch die Bewertung der ONT-read-Alignments auf Kandidatenrekonstruktionen gelöst
Validierung mit Strand-seq und Variantenanalyse
- Beim Vergleich von 65 Strand-seq libraries zwischen GRCh38-Y und T2T-Y zeigten sich in GRCh38-Y mehrere coverage spikes in umgekehrter Richtung
- Diese spikes deuten auf inversion polymorphisms zu HG002 hin und könnten auf Unterschiede im Haplogroup zurückgehen
- In T2T-X und T2T-Y wurden dieselben spikes nicht beobachtet, was die strukturelle und orientierungsbezogene Genauigkeit der HG002-Assembly bestätigt
- In einer unique sequence zwischen den palindromischen Armen von P5 wurde eine 3 kb inversion zunächst als T2T-Y-Fehler identifiziert, später aber als population polymorphic bestätigt und in dieser Assembly-Version daher nicht korrigiert
- In T2T-Y sind strand state changes in jeder Strand-seq library zufällig verteilt; es gibt keine Hinweise auf misassembly oder collapse
- Die Analyse der Extended Data zeigte, dass 5 von 15 Personen die P3 palindrome inverted variant von HG002 besitzen
PAR, Yq12 und non-B-DNA-Motive
- Im PAR1-subgraph deuteten green edge gaps und ungleichmäßige node coverage auf einen HiFi sequencing bias über PAR1 hinweg hin
- PAR1 ist reich an SINE repeats und non-B-DNA-Motiven, was eine Ursache der sequencing gaps sein könnte
- Die Analyse der Verteilung von non-B-DNA-Motiven über T2T-Y zeigte, dass HSat3 auf Yq und zentromernahe Satellitensequenzen stärker mit A-phased repeats, direct repeats und STR angereichert sind
- HSat1B ist stärker mit inverted repeats und mirror repeats angereichert
- Auch in der PAR-Region wurde eine non-B-DNA sequence enrichment beobachtet
- Das TSPY-gene array ist reich an G4- und Z-DNA-Motiven
- Jede TSPY-Kopie besitzt einen G4-Peak etwa 500 Basen stromaufwärts von TSPY
- Ein Quadron score von über 19 gilt als stabile G4-Struktur
Referenzsequenz-Ressource für 24 menschliche Chromosomen
- Die Forschenden kombinierten T2T-Y mit der bestehenden CHM13-Genom-Assembly und mappten verfügbare populationsbezogene Varianten-, klinische Varianten- und funktionelle Genomikdaten, um eine vollständige Referenzsequenz für alle 24 menschlichen Chromosomen zu erstellen
- Die vollständige Ressourcenliste kann unter marbl/CHM13 heruntergeladen werden
- T2T-CHM13v2.0, T2T-CHM13+Y assembly
- reference analysis set
- gene annotation, repeat annotation, epigenetic profiles
- variant-calling-Ergebnisse von 1KGP und SGDP
- Datensätze von gnomAD, ClinVar, GWAS, dbSNP
- Die Assembly ist auch bei NCBI und EBI verfügbar; die GenBank accession lautet GCA_009914755.4
- Annotationen und zugehörige Ressourcen lassen sich auch im UCSC Genome Browser unter
hs1, im Ensembl Genome Browser für T2T-CHM13v2.0 sowie im NCBI data-hub durchsuchen - Mögliche Assembly-Probleme können unter marbl/CHM13-issues eingesehen und nachverfolgt werden
Verfügbare Analysedaten und Code
- 1KGP- und SGDP-short-read-Alignments sowie variant calls sind im AnVIL workspace verfügbar
- Die Originaldaten des Gerton lab sind im Stowers Original Data Repository zugänglich
- Die in der Studie verwendeten sequencing data sind in Supplementary Table 1 aufgeführt
- Der für Datenanalyse und Visualisierung entwickelte custom code wurde auf GitHub und Zenodo veröffentlicht
- Die verwendete Software und die Parameter sind in den Supplementary Methods mit weiteren Details beschrieben
1 Kommentare
Hacker-News-Kommentare
Für alle, die sich nicht mehr an den früheren Wettlauf um die Entschlüsselung des menschlichen Genoms erinnern: Die damals führenden Konkurrenten waren Celera Genomics und das Human Genome Project.
Celera unter der Leitung von Craig Venter gab bekannt, die Sequenzierung abgeschlossen zu haben, verwendete tatsächlich aber die Shotgun-Methode, bei der aus vielen kleinen Stichproben statistisch ein Genommodell zusammengesetzt wurde, und räumte etwa fünf Jahre später ein, nicht das gesamte Genom sequenziert zu haben.
Siehe: https://www.technologyreview.com/2007/09/04/223919/craig-ven...
Damals wurde Shotgun-Sequenzierung als „Abkürzung“ kritisiert, heute ist Chromosome Walking verschwunden und Shotgun ist zum Standard geworden.
Wenn es abgelöst wird, dann wohl durch Long-Read-Technologien wie Oxford Nanopore; aber auch dort ist noch Datenassemblierung nötig, und man erhält noch keine direkt durchgehende Sequenz von Ende zu Ende.
Vor 35 Jahren: https://www.nytimes.com/1987/12/13/magazine/the-genome-proje...
Vor 33 Jahren: https://www.nytimes.com/1990/06/05/science/great-15-year-pro...
Vor 29 Jahren, der Wettbewerb verschärft sich: https://www.nytimes.com/1994/02/22/science/scientist-at-work...
Vor 24 Jahren, der Wettlauf läuft: https://www.nytimes.com/1999/03/23/science/who-ll-sequence-h...
Vor 23 Jahren, Entwurf fertiggestellt: https://archive.nytimes.com/www.nytimes.com/library/national...
Vor 20 Jahren: https://www.nytimes.com/2003/04/15/science/once-again-scient...
Vor 2 Jahren: https://archive.nytimes.com/www.nytimes.com/library/national...
Celeras Shotgun-Ansatz war anspruchsvoll, weil das Zusammensetzen der Fragmente enorme Rechenleistung und ausgefeilte Algorithmen erforderte; die finale Assemblierung lief auf einem Compaq AlphaServer GS160, da Algorithmus und Daten 64 GB Shared Memory benötigten.
Der GS160 war damals eine riesige UNIX-Maschine und ließ sich mit integrierter Ein-/Ausgabe und einem gemeinsamen Dateisystem über mehrere Maschinen hinweg eng clustern.
Hauptautor der Shotgun-Assemblierung war Gene Myers, der zuvor BLAST entwickelt und zusammen mit Udi Manber das Suffix Array erdacht hatte.
Auch das öffentliche Projekt hatte Probleme, weil viele Teams an manuellen, akademisch geprägten Ansätzen festhielten; Eric Lander verwandelte es später in einen industriellen Prozess und führte das in den Betrieb des Broad Institute weiter, eines privaten MIT/Harvard-Forschungsinstituts in Boston.
Heute werden täglich Sequenzdaten im Petabyte-Maßstab erzeugt und in der Cloud gespeichert, und das Genom ist zu einem grundlegenden Werkzeug der Forschung am Menschen geworden; sein Potenzial zum Verständnis komplexer Phänotypen ist aber noch nicht vollständig sichtbar geworden.
Was Celera getan hat, hatte Wert, und zumindest meinem Eindruck nach haben sie auch nicht verheimlicht, was sie getan hatten.
Statt von einem „statistischen Trick“ zu sprechen, sollte man es eher Innovation nennen.
Menschen haben unterschiedliche genetische Zusammensetzungen; ich frage mich daher, was genau es bedeutet, wenn man sagt, das menschliche Genom sei vollständig entschlüsselt worden.
Unterscheidet sich die Basensequenz von DNA/RNA nicht von Mensch zu Mensch?
https://www.nytimes.com/2002/04/27/us/scientist-reveals-secr...
Soweit ich weiß, haben jüngere Projekte eine breitere Gruppe von Individuen verwendet.
Manche Projekte mischen mehrere Individuen und sequenzieren sie gemeinsam, andere sequenzieren jede Person getrennt.
Die großräumige Struktur ist zwischen Menschen sehr ähnlich, und es gibt inzwischen ausgefeilte Methoden, individuelle Varianten zu modellieren; deshalb ist das kein großes Problem.
Graphstrukturen, die Alternativen innerhalb einer Referenzsequenz darstellen, werden unter https://www.biomedcentral.com/collections/graphgenomes beschrieben und können nicht nur einzelne Basenunterschiede, sondern auch komplexere Varianten wie große Deletionen, Rearrangements und Inversionen enthalten.
Das Referenzgenom ist so etwas wie der Rosetta Stone der Genomik: Es dient als Maßstab, an dem man DNA/RNA-Sequenzen anderer Individuen ausrichtet, versteht und vergleicht.
Perfekt ist es nicht; es kann Bereiche geben, die in der Referenz fehlen, oder stark variable DNA-Regionen.
Ziel des Human Pangenome Reference Consortium (HPRC) https://humanpangenome.org/ ist es, dieses Problem zu lösen, indem Individuen aus vielfältigen Populationen sequenziert werden; zugleich werden neue Rechenmodelle zur Analyse der Daten über die gesamte Population hinweg entwickelt.
Bei den anderen Chromosomen wurde ein ähnlicher Ansatz angewandt.
Wenn ein Genom aus vielen Megabyte von [ATCG]+ besteht, frage ich mich, was es einem sagt, diese Sequenz zu haben.
Schaut man sie einfach an und sagt: „Ah, ...ATGCTACGACTACGACTAGCG... interessant“?
Anfang dieses Jahres gab es dazu einige viel beachtete Arbeiten, darunter einen Nature-Artikel von Guarracino und Garrison.
Ein Pangenom ist üblicherweise ein komplexes Graphmodell, das Hunderte oder mehr Genome/Haplotypen einer Art miteinander verknüpft; konzeptionell lässt es sich auch über Arten hinaus oder auf Zellen innerhalb eines Individuums ausdehnen, etwa auf ein Krebs-Pangenom.
In einem idealisierten menschlichen Pangenom-Graphen wird jede Person durch die zwei Stränge auf jedem Autosom sowie durch Stränge über die X- und Y-Chromosomen und das mitochondriale Genom dargestellt.
Ich verstehe den Grund, warum Gensequenzierung schwierig ist, so: Die meisten Verfahren teilen lange Gensequenzen zunächst zufällig in Stücke und sequenzieren dann jedes Stück separat.
Damit daraus das gesamte Genom wird, müssen diese Stücke wieder in die richtige Reihenfolge gebracht werden. Das ist wegen der Überlappungen zwischen den Fragmenten zwar möglich, aber bei Wiederholungsabschnitten lassen sie sich allein über Überlappungen nur schwer korrekt zusammensetzen.
Es gibt auch eine neue Methode namens Nanopore, bei der DNA tatsächlich durch eine kleine Pore geleitet wird und sich die elektrischen Eigenschaften je nach den Basenpaaren in der Pore ändern.
Allerdings neigt sie dazu, abhängig von der Sequenz auf deterministische Weise Fehler zu erzeugen; da ich den vollständigen Artikel nicht sehen kann, weiß ich nicht genau, was hier gemacht wurde, aber ich habe schon gehört, dass man die beiden Ansätze kombiniert.
Anschließend nutzten sie Nanopore-Sequenzierung, um die HiFi-Contigs zu verbinden und die wirklich schwierigen Bereiche des Chromosoms abzudecken.
So wie ich es verstanden habe, ist moderne Sequenzierung im großen Maßstab durchweg Shotgun-Sequenzierung.
Man zerschneidet DNA zufällig und sequenziert jedes Fragment; danach werden die einzelnen Fragmente, die Reads, mit einem Genom-Assembler zusammengesetzt.
Ich hatte immer diese „dumme Frage“ zu Meldungen über das menschliche Genom.
Wir alle haben unterschiedliche DNA; ist das „menschliche Genom“ also so etwas wie Durchschnitts-DNA, die DNA einer als Probe ausgewählten Person, oder ein Überblick über das, was uns allen gemeinsam ist?
Die Unterschiede zwischen Menschen sind relativ klein, etwa einige Millionen Basen unter drei Milliarden.
Historisch war das Referenzgenom eher ein Durchschnitt bzw. Mosaik aus mehreren Individuen. Das hat klare Nachteile, reichte aber aus, um Reads im Allgemeinen an die richtige Stelle zu setzen und Varianten zu bestimmen, also die Unterschiede, die das untersuchte Genom einzigartig machen.
Die aktuelle End-to-End-T2T-Referenz basiert dank neuer Informationen aus Long-Read-Technologien vollständig auf der Person HG002 aus Utah.
Wenn man ein Populationsmodell des Genoms braucht, braucht man ein Pangenom.
Siehe „pangenome graph“, „variation graph“ und das Human Pangenome Project.
Diese Nachricht sollte nicht auf jetzt, sondern auf Dezember letzten Jahres datiert sein.
Das T2T-Team veröffentlichte im vergangenen Dezember einen Preprint [1] und im März die Daten [2], aber wegen des Peer-Review-Prozesses ist die Arbeit erst jetzt offiziell in Nature erschienen.
Publikationspläne können wirklich langsam sein, und interessierte Wissenschaftler wussten bereits davon und arbeiten schon mit dieser Assemblierung; in solchen Fällen frage ich mich, welchen Sinn die formale Veröffentlichung noch hat.
[1] https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.12.01.518724v1....
[2] https://github.com/marbl/CHM13
Ist das eher „es gibt einen funktionierenden Tastaturtreiber“, oder eher „wir haben alle 104 Tasten des standardmäßigen 104-Tasten-US-QWERTY-Layouts identifiziert“?
Einige CNC-Befehle verstehen wir, aber die Steuerungsmechanismen oder die Reihenfolge noch nicht wirklich gut.
Irgendwann werden wir die Tasten identifizieren, aber von einem Treiber sind wir noch sehr weit entfernt – und, noch wichtiger, auch davon zu verstehen, was die einzelnen Tasten tun.
Allerdings haben wir herausgefunden, dass die Tastatur auf interessante Weise kaputtgeht, wenn man bestimmte Bits in den Rohdaten verändert.
Das ist eine ziemlich große Sache.
Es bedeutet, dass jetzt alle 24 Chromosomen vollständig entschlüsselt sind; und wie im Abstract steht, war das Y-Chromosom wegen seiner Eigenschaften bisher schwer zu entschlüsseln.
Danach war es 2022 abgeschlossen, und jetzt heißt es schon wieder, es sei abgeschlossen.
Ich frage mich, ob es noch weitere Meilensteine auf dem Weg zu einem erneuten „Abschluss“ gibt.
Galt das Y-Chromosom bis jetzt wirklich als Ausnahme?
Als Nebenbemerkung: Ich kann das sehr interessante und lehrreiche Buch Y - The Descent of Man von Steve Jones sehr empfehlen.
Es ist spannend zu sehen, wie immer mehr Chromosomen kartiert und entschlüsselt werden.
Mit Biologiewissen auf Oberstufenniveau gefragt: Sind wir bei Genen, Genexpression und Wechselwirkungen schon über Korrelationen hinaus zu einem deterministischen Verständnis gelangt?
Am Beispiel „blaue Augen“: Wir wissen [1], dass OCA2 an brauner/blauer Augenfarbe beteiligt ist, aber können wir sicher sein, dass die übrigen 20.000 Gene überhaupt nicht beteiligt oder nicht notwendig sind?
Laienhaft vermutet scheint es mir, als müssten mehrere Gene eingeschaltet, aktiviert oder vorhanden sein, damit blaue Augen entstehen; eher wie ein Rezept als ein einfaches On/Off an einer einzelnen Stelle.
[0] https://www.goodreads.com/work/editions/436071-y-the-descent...
[1] https://www.nature.com/articles/s41433-021-01749-x
Schon die Frage, wie man blaue Augen definiert, ist ein Problem.
Es gibt nicht einen einzelnen Phänotyp, sondern verschiedene Bereiche blauer Augen, und diese Unterschiede entsprechen ziemlich feinen Variationen zwischen Menschen.
Das verlinkte Paper [1] ist ziemlich gut, aber um es vollständig zu verstehen, braucht man einiges an Zeit.
Schließlich braucht man Augen, um blaue Augen zu haben, und um die Farbe zu prüfen, braucht man auch diverse Mechanismen, mit denen man die Augen öffnet.
Zum Beispiel hat sich erst relativ kürzlich die Epigenetik stark weiterentwickelt; grob gesagt untersucht sie, wie sich das Verhalten von Zellen ändern kann, ohne dass sich die DNA selbst verändert [1].
Dadurch stellt sich die alte Frage nach Umwelt- und Erbeinfluss noch einmal differenzierter.
Ich bin nicht völlig sicher, wie viele Chromosomen an der Bestimmung der Augenfarbe beteiligt sind, aber es gibt recht gute Schätzungen.
Eine neuere Schätzung liegt bei etwa 16; OCA2 und HERC2 haben den größten Einfluss, aber viele andere Gene tragen kleinere Effekte bei [2].
Das zitierte Paper ist hervorragend, behandelt aber auch Themen wie Genregulation, Introns und Exons, die eher zu einführender Universitätsbiologie bzw. AP Biology gehören als zur üblichen Oberstufenbiologie.
Allgemeiner gesagt glaube ich nicht, dass wir in der Genetik bald an den Punkt kommen, an dem man irgendetwas zu 100 % vollständig deterministisch sagen kann.
Genetik und Biologie insgesamt haben enorme Fortschritte gemacht, aber man sollte die Komplexität des menschlichen Genoms keinesfalls unterschätzen.
Es gibt eindeutig Dinge, die wir noch nicht verstehen, und das wird noch eine Weile so bleiben.
Praktisch gesehen können selbst bei einfachen Phänotypen wie Augenfarbe andere Gene eine Rolle spielen, aber meist lässt sie sich mit nur wenigen Genen schon recht genau abschätzen.
Eine Studie etwa sagte die Augenfarbe mit nur 6 Genen mit etwa 75 % Genauigkeit voraus [3].
Noch interessanter ist, dass Gene, die einen Phänotyp beeinflussen, nicht immer die genetische Information, die dieses Merkmal bestimmt, direkt speichern.
Das heißt, das Gen bestimmt das Merkmal nicht direkt, sondern beeinflusst andere Gene, und diese anderen Gene sind direkter an der Ausprägung des Merkmals beteiligt.
Wenn mehrere Gene einander beeinflussen und wiederum weitere Gene beeinflussen, und Studien zusätzlich Umwelt- und demografische Verzerrungen berücksichtigen müssen, sieht man, wie schnell Genetik kompliziert wird.
[1] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2791696/
[2] https://www.nature.com/articles/jhg2010126
[3] https://doi.org/10.1016/j.cub.2009.01.027
Das sind spannende Neuigkeiten.
Wenn ihr wissen wollt, welche Anwendungen diese Arbeit hat, schaut euch diese ACM-SIGPLAN-Keynote an: https://youtu.be/JTU3JYp3JYc?si=jOZz611ATQar3Gec
Sie hat mir beim Verständnis von DNA mehr geholfen als der gesamte Biologieunterricht in der Schule.